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曲霉屬通用PCR試劑盒反應(yīng)的五點(diǎn)要素
點(diǎn)擊次數(shù):1662 更新時(shí)間:2020-09-29

曲霉屬通用PCR試劑盒注意事項(xiàng):

1.基礎(chǔ)程序;

2.?dāng)U增溫度和延伸溫度;

3.反應(yīng)時(shí)間;

4.循環(huán)次數(shù);

5.PCR 反應(yīng)液的配制;

6.PCR技術(shù)的基本原理;

7.PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué);

8.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;

9.PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。


曲霉屬通用PCR試劑盒反應(yīng)五要素:
 
參加曲霉屬通用PCR試劑盒反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

引物:引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵,PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論

上,只要知道任何一段模板DNA序列, 就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物,利用PCR就可將模

板DNA在體外大量擴(kuò)增。設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則:

①引物長度: 15-30bp,常用為20bp左右。

②引物擴(kuò)增跨度: 以200-500bp為宜,特定條件下可擴(kuò)增長至10kb的片段。

③引物堿基:G+C含量以40-60%為宜,G+C太少擴(kuò)增效果不佳,G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。

ATGC*隨機(jī)分布,避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu),避免兩條引物間互補(bǔ),特別是3'端的互補(bǔ),否則會(huì)形成引物二聚體,

產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。

⑤引物3'端的堿基,特別是末及倒數(shù)第二個(gè)堿基,應(yīng)嚴(yán)格要求配對,以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)

致PCR失敗。

⑥引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn), 被擴(kuò)增的靶序列*有適宜的酶切位點(diǎn), 這對酶切分析或分子克

隆很有好處。

⑦引物的特異性:引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。引物量:每條引物的濃度0.1~

1umol或10~100pmol,以*引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好,引物濃度

偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增,且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。

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